É uma raça de guarda, embora muito amigável e dócil com seus donos. Relaciona-se muito bem com crianças e outros animais não caninos, principalmente quando criados desde pequenos. O Mastino Napolitano possui um temperamento equilibrado o que faz com que seja moderadamente agressivo e barulhento. Late quando necessário e avança somente em casos de ameaça à casa ou à família. É desconfiado com estranhos e não aceita bem outros cães, principalmente do mesmo sexo. Essa raça costuma babar muito. 

Para controlar um animal desse porte e com instintos de guarda é altamente recomendado um bom treino de obediência. O dono de um Mastino Napolitano deve ser o seu líder e ensinar a família toda a dominar o cão. É calmo e confiante, mas seu perfil dominante e perfil pode se destacar. É mais propenso a morder e atacar pessoas do que outros pedigrees. O ideal é passear sempre com focinheira e ser muito bem educado para evitar qualquer dano a terceiros.

Quando filhotes são amigáveis, mas conforme amadurecem ficam mais reservados. Com estranhos, por exemplo, não são receptivos e encaram essas pessoas como ameaças ao seu território.

Podem se relacionar bem com crianças, desde socializados e que as brincadeiras não sejam muito brutas. O porte gigante da raça pode machucar sem querer pessoas mais frágeis. Para idosos, inclusive, não é uma raça recomendada. A maioria dos especialistas não indica o Mastino Napolitano para famílias com filhos, pelo risco de serem feridos. Pode se tornar dominante e irritar-se com barulhos e movimentos bruscos das crianças.

É um cão inteligente e capaz de aprender rápido, mas para isso precisa de um tutor firme para poder respeitá-lo. Normalmente os donos ficam satisfeitos com o resultado dos treinamentos. É bom lembrar, por outro lado, que esse adestramento suaviza o comportamento agressivo, porém não elimina de vez e a família deve estar sempre atenta. 

O Mastino Napolitano exige menos exercícios diários do tutor do que muitas raças, embora seja ativo quando comparado às de porte gigante como ele. Ficará tranquilamente deitado no sofá, do mesmo jeito que vai gostar de brincar com a bolinha, mas algumas caminhadas por semana dão conta da energia desse cão. No entanto, se ficar horas sozinho em casa e sem atividades para estimular a mente pode se tornar destrutivo e irritado.